1977年，英国人Fred Sanger发现在DNA复制过程中掺入ddNTP，会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。由此诞生了以Sanger命名的测序原理即双脱氧链终止法测序原理。
Sanger法测序的原理：（见下图）
)window.location='http://tp/UploadFiles/image/2014914109515101.001.jpg')
)window.location='http://tp/UploadFiles/image/20149141010426585.002.jpg')
Q1.DNA测序的原理是什么？步骤如何？ABI 3730XL测序的准确程度如何？
答：
DNA测序的原理是末端终止法。具体步骤如下：
1． 定量：对样品及引物进行定量。
2． 测序反应：在反应体系中加入已定量的模板和引物，BigDye等试剂，PCR仪上完成测序反应。
3． 读取数据：根据荧光的不同，读取被测样品的碱基序列。
ABI公司目前承诺测序结果在800bp以内准确率为98.5%。
Q2.为什么在测序报告上找不到我的引物序列？
答：
1. 如果您提供的样品是PCR产物，在测序报告上找不到您的引物是正常的。这是因为测序反应是通过对被荧光标记的ddNTP的读取而获得基因序列的，而测序引物由于没有荧光标记，因此自然在测序结果中就不会被识别。有两种方法可以得到您的引物序列。对于较短的PCR产物（<800bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。
2. 如果您提供的样品是质粒或菌液，PCR产物用载体克隆后，由于克隆的方向是随机的，因此，当您在一条链上找不到您的引物序列时,请尝试在互补链上寻找您的引物序列。
3. 当测序引物离您的插入片段很近时，有时可能也无法找到您的引物的全序列。这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或引物二聚体的干扰，造成起始区的序列不好，可能无法找到您的引物完整序列。
4. 有时，质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外援片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时自然也找不到引物序列。
Q3. 我的引物做PCR效果很好，为什么用于测序总得不到好的结果？
答：
用于测序的引物比用作PCR反应的引物要求高，以下是不适合用于测序反应的引物类型：
1. 不纯的引物：用于测序的引物纯度要求很高，合成中的小片段会直接造成严重的背景峰，因此用于测序的引物序列长度一般在24个碱基之内，因为过长的引物纯度不易保证。
2. 简并引物，随机引物和有特殊标记的引物。
| 引物名称 | 引物序列 |
| 3'AOX | 5'-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3' |
| 35s | 5'-GACGCACAATCCCACTATCC-3' |
| 3'AD | 5'-AGATGGTGCACGATGCACAG-3' |
| 3'BD | 5'-TAAGAGTCACTTTAAAATTTGTATC-3' |
| 5'AOX1 | 5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3' |
| ACYCDuetUP1Primer | 5'-GGATCTCGACGCTCTCCCT-3' |
| A-FACTOR | 5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3' |
| AUG1F | 5'-CAATTTACATCTTTATTTATTAACG-3' |
| AUG1R | 5'-GAAGAGAAAAACATTAGTTGGC-3' |
| BAC1 | 5'-AACCATCTCGCAAATAAATA-3' |
| BAC2 | 5'-ACGCACAGAATCTAGCGCTT-3' |
| BGH rev | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGGC-3' |
| C-CMV-24 | 5'-TTAGGACAAGGCTGGTGG-3' |
| CMV-F | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' |
| CMV-Profor | 5'-ATGGGCGGTAGGCGTG-3' |
| CMV-R | 5'-GTTCACGGTGCCCTCC-3' |
| c-mycrev | 5'-CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG-3' |
| DEST22F | 5'-TATAACGCGTTTGGAATCACT-3' |
| DEST22R | 5'-AGCCGACAACCTTGATTGGAGAC-3' |
| DsRed1-C-r | 5'-AGCTGGACATCACCTCCCACAACG-3' |
| DsRed1-N-f | 5'-GTACTGGAACTGGGGGGACAG-3' |
| DsRed1-N-primer | 5'-GTACTGGAACTGGGGGGACAG-3' |
| DuetDOWN1 | 5'-GATTATGCGGCCGTGTACAA-3' |
| DuetUP2 Primer | 5'-TTGTACACGGCCGCATAATC-3' |
| EBV Reverse | 5'-TGTGGTTTGTCCAAACTCAATC-3' |
| EBV-R | 5'-GTGGTTTGTCCAAACTCATC-3' |
| EGFP-Nrev | 5'-CGTCGCCGTCCAGCTC-3' |
| EMCVIRES reverse: | 5'-CCTTATTCCAAGCGGCTTCGG-3' |
| GAL4 AD-F | 5'-TACCACTACAATGGATG-3' |
| GAL4 BD | 5'-TCATCGGAAGAGAGTAG-3' |
| GLP1 | 5'-TGTATCTTATGGTACTGTAACTG-3' |
| GLP2 | 5'-CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA-3' |
| GST-CS（Cfor） | 5'CCAGCAAGTATATAGCATGGCC-3' |
| H1primer | 5'-CGCTATGTGTTCTGGGAAAT-3' |
| HGHrev | 5'-CTGGGGAGGGGTCACAGGG-3' |
| M13(-96) | 5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3' |
| M13F | 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' |
| M13F（-47） | 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' |
| M13R | 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' |
| M13R(-26) | 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' |
| M13R（-48） | 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3' |
| malEfor | 5'-GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC-3' |
| mtDNA-D-LoopF | 5'-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3' |
| mtDNA-D-LoopR | 5'-ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG-3' |
| Mtfor | 5'-CATCTCAGTGCAACTAAA-3' |
| N-CMV-30 | 5'-ATAACCCCGCCCCGTTG-3' |
| P12584 | 5'-TTTTCAGTATCTACGAT-3' |
| P17110 | 5'-TACCACTACAATGGATG-3' |
| P24990 | 5'-TCATCGGAAGCGAGTAG-3' |
| P31430 | 5'-CGTTTTAAAACCTAAGAGTCAC-3' |
| PAS2-1F | 5'-TCATCGGAAGCGAGTAG-3' |
| PAS2-1R | 5'-CGTTTTAAAACCTAAGAGTCAC-3' |
| PB42ADF | 5'-CCAGCCTCTTGCTGAGTGGAGATG-3' |
| PB42ADR | 5'-AAGCCGACAACCTTGATTGGAG-3' |
| pBAD_F | 5'-ATGCCATAGCATTTTTATCC-3' |
| pBAD_R | 5'-GATTTAATCTGTATCAGG-3' |
| pbd-gal4-f | 5'-GCCTCTAACATTGAGACAGC-3' |
| pbd-gal4-r | 5'-AAGAGTTACTCAAGAACAAGAA-3' |
| pbi-121(35s) | 5'-GACGCACAATCCCACTATCC-3' |
| pBMN_5' | 5'-GCTTGGATACACGCCGC-3' |
| pBRforBam | 5'-CTTGGAGCCACTATCGAC-3' |
| pBRforEco | 5'-AATAGGCGTATCACGAGGC-3' |
| pBRrevBam | 5'-GGTGATGTCGGCGATATAGG-3' |
| pBRrevHind | 5'-GCGTTAGCAATTTAACTGTG-3' |
| PBV220F | 5'-AAGAAGGGCAGCATTCAAAG-3' |
| PBV220R | 5'-CTGCGTTCTGATTTAATCTG-3' |
| pCAMBIA1301-3'(HindIII) | 5'-GCGATTAAGTTGGGTAACGC-3' |
| pCAMBIA1301-5'(ECORI) | 5'-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3' |
| PCDNA3.0-F2 | 5'-CTCTGGCTAACTAGAGAACC-3' |
| PCDNA3.0-R2 | 5'-GGCAACTAGAAGGCACAGTC-3' |
| PCDNA3.1F | 5'-CTAGAGAACCCACTGCTTAC-3' |
| PCDNA3.1R | 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3' |
| pCEP Frorward | 5'-AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3' |
| PCEP-F | 5'-AGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3' |
| PCMV-F | 5'-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT-3' |
| PCMV-F | 5'-TTCCAAAATGTCGTAATAAC-3' |
| PCMV-R | 5'-TCCAAACTCATCAATGTATC-3' |
| PCMV-R | 5'-ATTATAGAGGACACCTAGTC-3' |
| pDBLeu-3' | 5'-CAGATGGAACGGTCTTTAAATG-3' |
| pDBLeu-5' | 5'-GAATAAGTGCGACATCATCATC-3' |
| PDONR-F | 5'-TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC-3' |
| PDONR-R | 5'-GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC-3' |
| pDsRED-express-C1-F | 5'-TCCCACAACGAGGACTACAC-3' |
| pDSRED-N-R | 5'-TGAAGCGCATGAACTCCTTG-3' |
| PEF-F | 5'-TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC-3' |
| pEGFP1F | 5'-CGGCAGGGTCGGAACAGG-3' |
| PEGFP-C-3' | 5'-TATGGCTGATTATGATCAGT-3' |
| PEGFP-C-5' | 5'-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3' |
| PEGFP-N-3' | 5'-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3' |
| PEGFP-N-5' | 5'-TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG-3' |
| pETup | 5'-ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGA-3' |
| pGAL4-ADrv | 5'-GAACTTGCGGGGTTTTTC-3' |
| pGAL4-BDrv | 5'-AATCATAAGAAATTCGCCC-3' |
| pGAP Forward | 5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3' |
| PGEX-3' | 5'-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3' |
| PGEX-5' | 5'-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3' |
| PIRES2-EGFP-F | 5'-GTAGGCGTGTACGGTGGGAG-3' |
| PIRES3-EGFP-R | 5'-AACGCACACCGGCCTTATTC-3' |
| pJET1.2-F | 5'CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3' |
| pJET1.2-R | 5'AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3' |
| pLEXA-F | 5'-CGTCAGCAGAGCTTCACCAT-3' |
| pLEXA-R | 5'-TAAAACCTAAGAGTCACTTT-3' |
| pLNCX-F | 5'-AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCG-3' |
| pLNCX-R | 5'-ACCTACAGGTGGGGTCTTTCATTCCC-3' |
| pLXSN-F | 5'-CTTGAACCTCCTCGTTCGAC-3' |
| pLXSN-R | 5'-GTTGCTGACTAATTGAGATG-3' |
| pMAL-C2X-F | 5'-TGCGTACTGCGGTGATCAAC-3' |
| pMAL-C2X-R | 5'-CTGCAAGGCGATTAAGTTGG-3' |
| pMD19T490R | 5'-CACAGGAAACAGCTATGACC-3' |
| pMSCV-3' | 5'-GAGACGTGCTACTTCCATTTGTC-3' |
| pMSCV-5' | 5'-CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3' |
| PPC86-F | 5'-TATAACGCGTTTGGAATCACT-3' |
| PPC86-R | 5'-GTAAATTTCTGGCAAGGTAGAC-3' |
| PQE30F | 5'-TGAGCGGATAACAATTTCAC-3' |
| PQE30R | 5'-GTTCTGAGGTCATTACTGG-3' |
| pRECEIVER-M03F | 5'-GCGGTAGGCGTGTACGGT-3' |
| pRECEIVER-M03R | 5'-CCGGACACGCTGAACTTGT-3' |
| Primer TriplEx-LD-5' | 5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGG-3' |
| Primer TriplEx-LDrv-3' | 5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGC-3' |
| PSG5(BAMHI)-F | 5'-GCTGGTTATTGTGCTGTCTC-3' |
| pSG5-3 | 5'-GAAATTTGTGATGCTATTGC-3' |
| PSG5-R(SV40) | 5'-AAACCACAACTAGAATGCAGT-3' |
| Psos3' | 5'-GCCAGGGTTTTCCCAGT-3' |
| Psos5' | 5'-CCAAGACCAGGTACCATG-3' |
| pTARGET-SEQ | 5'-TTACGCCAAGTTATTTAGGTGACA-3' |
| PTR5 | 5'-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3' |
| PTRC99C-F | 5'-TTGCGCCGACATCATAAC-3' |
| PTRC99C-R | 5'-CTGCGTTCTGATTTAATCTG-3' |
| PTRCHISA-F | 5'-CATGGTATGGCTAGCATGAC-3' |
| PTRCHISA-R | 5'-CAGGCTGAAAATCTTCTCTC-3' |
| pTrcHis-fw | 5'-TTAAAGAGGTATATATTAATGTATCG-3' |
| pTrcHis-rv | 5'-ATCTGTATCAGGCTGAAAATC-3' |
| pYes2.R | 5'-TCGGTTAGAGCGGATGTG-3' |
| RVP3 | 5'-CTAGCAAAATAGGCTGTCCC-3' |
| RVP4 | 5'-GACGATAGTCATGCCCCGCG-3' |
| S.TAG | 5'-CGAACGCCAGCACATGGACA-3' |
| S1 | 5'-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3' |
| S6 | 5'-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3' |
| SP6 | 5'-ATTTAGGTGACACTATAG-3' |
| T3 | 5'-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3' |
| T7 | 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' |
| T7 EEV | 5'-ATGTCGTAATAACCCCGCCCCG-3' |
| T7（17BASE） | 5'-ACATCCACTTTGCCTTTCTC-3' |
| T7TER | 5'-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' |
| TKPAreverse | 5'-CTTCCGTGTTTCAGTTAGC-3' |
| TRXF | 5'-CATATGAGCGATAAAATTATTCAC-3' |
| TRXR | 5'-GGATCCCTTGTCATCGTCATCACCA-3' |
| U6 | 5'-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3' |
| UB-F | 5'-TCAGTGTTAGACTAGTAAATT-3' |
| V5rev | 5'-ATCGAGACCGAGGAGAGG-3' |
| Xpressfor | 5'-AGCATGACTGGTGGACAG-3' |
| 27F | 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' |
| 515F | 5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
| 21F | 5'-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3' |
| 312F | 5'-TCCTACGGGAGGCAGCAGCT-3 |
| 1492R | 5'-GGTACCTTGTTACGACTT-3' |
| 1525R | 5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3' |
| nu-SSU-0817-5' | 5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3' |
| nu-SSU-1536-3' | 5'-ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3' |
| ITS1 | 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' |
| ITS4 | 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' |
| ITS5 | 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' |
测序样品要求
1. PCR原液
o 片断通常大于200bp；
o 提供浓度大于50ng/ul，体积大于50ul；
o 2ul电泳检测条带清晰无杂带。
2. PCR已纯化
o PCR产物溶于超纯水中；
o 浓度大于50ng/ul，体积大于20ul；
o 电泳检测条带单一。
3. 质粒要求
o 质粒浓度大于100ng/ul，体积大于20ul；
o .建议使用相关试剂盒提取；
o 建议同时提供1ml菌液；
o 大质粒需要注明载体长度。
4. 菌液模板要求
o 说明载体的抗性，我们提供Amp 、kan、chl、tet四种抗生素；
o 对于低拷贝质粒请直接提供1ug纯化质粒；
o 提供1ml左右的过夜培养菌液，加15%灭菌甘油，于离心管中封口保存，防止交叉污染或泄漏，特别是热天路远的最好是这样处理一下以免菌死掉，但容易污染；
o 建议尽量提供穿刺培养的菌种，或用新鲜的菌装到冰盒里运输
5. 引物要求
o .浓度大于3.2umol/l，体积大于20ul；
o 随机引物和兼并引物不适合测序；
o 尽可能提供引物全序列，PCR退火温度；.
o T7、SP6、M13(+)、M13(-)、T3等通用引物我们免费提供。
样品类型及注意事项
|
样品类型 |
收费标准 |
注意事项 |
| 菌 | 500-1000ul新鲜菌液 | 可以提供5ml菌液或沉淀菌体直接提取质粒 |
| 质粒 | 浓度要求大于100ng/ul，大于20ul（反应个数多相应增加） | 建议送前鉴定浓度。建议不要溶于TE，要溶于超纯水。因为TE离子浓度很高，抑制测序反应，建议纯化后溶于15-20ul超纯水中 |
| PCR已纯化 | 浓度要求大于50ng/ul，20ul左右（反应个数多相应增加） | 建议送前鉴定浓度。请注意我处是取2ul原液用1％琼脂糖胶鉴定，客户经常会取5ul鉴定。建议纯化后溶于15-20ul超纯水中 |
| PCR未纯化 | 浓度要求大于50ng/ul，大于50ul（不宜分离相差小于150BP的多个片段） | 建议送前鉴定浓度。请注意我处是取2ul原液用1％琼脂糖胶鉴定，客户经常会取5ul鉴定。如浓度过低我们会直接停止实验，通知客户重供样。 |
|
现象描述 |
可能原因 |
是否收费 |
| 菌培养不好或失败 | 挑克隆有误，菌污染，订单提供信息有误 | 否 |
| 质粒抽提不成功 | 质粒太大或活化方式不好、转化不好、拷贝数低、培养方式不当 | 否 |
| 测序无信号、信号弱 | 引物与模板结合不好（引物或模板原因） | 否 |
| 鉴定质粒或PCR浓度低，取消实验 | 建议PCR（20ul） 、质粒（30ul）去离子水溶解 | 否 |
| 设计引物和序列拼接 | 大片段测序 | 否 |
| 抽提出质粒但测序不成功 | 引物与模板结合不好（引物或模板原因） | 否 |
| 测序杂峰 | 引物不纯，模板不纯 | 是 |
| 信号中断或衰减 | 高级结构，GC rich，重复序列。 | 是 |
| 测序双峰 | 非单克隆、杂合子、引物特异性差、重复序列、Poly（A/T/G/C）结构、PCR非特异性扩增 | 是 |
| 空载体 | 插入失败,培养过程中片段丢失 | 是 |
| 客户提供引物导致结果不理想 | 引物不纯，引物不合适测序 | 是 |
| PCR原液纯化后但测序不成功 | 引物与模板结合不好（引物或模板原因） | 收纯化费,不收测序费 |
1、全新的3730XL测序仪：
)window.location='http://tp/UploadFiles/image/20149141016485124.003.jpg')
3730XL测序仪可以高自动化操作，2小时左右即可达到测序要求；液体分离胶使读序长度达1100bp，精确读长达800bp。利用Seqence5.2新型碱基识别与质量评分软件，测序准确性有了极大的提高；电泳温度可达70C，有效去除二级结构的影响；双色激光两侧同时激发，使得灵敏度极高，荧光信号强度高度均匀，提高了测序模板DNA的浓度的适应范围并且能进行超速测序。
2、高素质测序队伍：
测序人员都是分子生物学本科以上学历，并经过了严格培训；熟练掌握所有测序仪器和测序相关实验，认真负责的工作态度，绝不搞错客户的测序样品，绝不把实验交给实习生，保证差错率做到最小甚至杜绝！
3、测序速度快：
菌和PCR未纯化48小时内出结果；质粒和PCR已纯化，24小时出结果。
4、价格合理：
根据不同样品定出不同价格，有价可以测，有样品就可以测，用最优惠最合理的价格充分配合你的实验和经费。
5、困难模板特殊服务：
高GC，发夹结构，POLY结构等，根据不同模板做出不同测序方案，量身定做，使你在测序中节省更多时间，实验顺利进行。
6、保密性强：
交给我们东西无原则绝对保密。